叶传忠　陈仕平　裴雪涛　冯凯　李梁 中华实验外科杂志 2000年第1期第17卷 简报

　　本实验旨在研究流式细胞术(flow cytometry,FCM)在膀胱癌细胞的多药耐药分析方面的作用，现报道如下。

　　一、材料与方法

　　1.试剂及仪器：DMEM、DNA提取试剂盒DNAzol、RNA提取试剂盒Trizol为Gibco产品；秋水仙素、甲酰胺、polybrene为Sigma产品；缺口平移系统(nick translation)为Promega产品，尼龙膜为Zeta Probe产品；鲑鱼精DNA购自晶美生物公司；MDR-1 pCR引物P1：5′CCCATCATTGCAATAGCAGC-3′,P2:5′-CTTCAAACTTCTGCTCC

　　tGA-3′［1］，由军事医学科学院放射医学研究所合成；抗P-gp单克隆抗体JSB1购自福州迈新公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术公司；阿霉素由法玛西亚公司福建办事处提供；FCM检测由北京中医研究院西苑医院流式细胞室完成。

　　2.细胞株：转导人mdr-1 cDNA的逆转录病毒包装细胞PA317/PHamdr-1/A由本室保存［1］。人膀胱癌细胞株EJ由北京医科大学泌尿外科研究所提供。以上细胞均生长于DMEM培养基中，其中含体积分数为10%的胎牛血清和200 mmol/L的L-谷氨酰胺，在体积分数为5%的CO2、37℃培养箱中培养。逆转录病毒转染EJ细胞参照文献［1］进行。

　　3.转mdr-1基因细胞系EJ/MDR的鉴定：(1)PCR分析mdr-1基因的整合：参照DNAzol dNA提取说明书提取EJ/MDR-1细胞基因组DNA，取1 μl DNA用于PCR扩增。50μl体系：200 μmol/L dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+，2种引物各0.5 μmol/L，95℃预变性1 min，加Taq酶2 U(Promega公司)。PCR仪上扩增：94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环后72℃延伸7 min，2%琼脂糖凝胶电泳检测167 bp特异扩增带。(2)外源基因在转染细胞的表达分析：mdr-1基因cDNA探针用StuⅠ酶切质粒PHamdr-1/A获得，DIG缺口平移法标记探针，按Trizol说明书提取细胞总RNA，甲醛变性电泳检测RNA的质量，紫外吸收法定量，按文献［4］进行RNA dotblot。

　　4.间接免疫荧光分析：收集对数生长期EJ/Mdr-1及EJ细胞，PBS洗涤、离心2次。调节细胞浓度至1.0×105个/ml,加入P-gp单抗JSB115 mg/L,4℃放置30 min；冷PBS洗2次，加入FITC标记羊抗鼠IgG，FCM检测P-gp蛋白表达；参照文献［3］行抗体稀释及细胞固定，4℃继续放置30 min；冷PBS洗2次后送检。

　　5.FCM测定转基因细胞内阿霉素浓度：参照文献［3］进行。MTT法检测EJ/mdr-1细胞对化疗药物的体外敏感性：参照文献［4］进行。

　　二、结果

　　用PA317/PHamdr-1/A病毒上清转染的EJ细胞，秋水仙素(120 μg/L)加压筛选3周，获得抗性克隆，命名为EJ/mdr-1，培养传代。提取EJ/mdr-1细胞DNA行PCR检测，可特异性扩增出167 bp的mdr-1基因片段，而其亲代EJ细胞则未扩出此片段，从而证实有mdr-1基因的整合。提取已转导mdr-1基因的EJ细胞RNA，Dotblot结果证实EJ/mdr-1细胞中有mdr-1mRNA表达。mdr-1在EJ及EJ/mdr-1的阳性表达率分别为(7.5±2.1)%和(19.6±4.3)%，差异有显著性(P＜0.05)。EJ/mdr-1及EJ细胞内阿霉素荧光强度分别为16.85±4.12和5.59±3.65，差异有显著性(P＜0.05)，MTT法检测发现，EJ/mdr-1细胞对阿霉素、秋水仙素的耐药倍数分别是其亲代EJ细胞的7.2倍和9.5倍，差异均有显著性(P＜0.01)。

　　三、讨论

　　我们采用逆转录病毒介导将mdr-1基因转入人膀胱癌细胞株EJ，经PCR、Dotblot检测证明mdr-1基因的整合及mRNA水平的表达，FCM结果表明转染细胞的P-gp表达也有提高，并最终导致细胞内药物浓度下降，对阿霉素、秋水仙素等亲脂性化疗药物的敏感性降低，说明膀胱癌的多药耐药性与MDR基因及其产物的P-gp过表达有关。

　　基金项目：福建省卫生厅青年基金资助项目(Q9702)

　　参考文献

　　［1］Feng K,Pei xT,Wang LH，et al.Priliminary study ofretroviral mediated transfer of the human mdr-1 gene into murine and human hematopoietic stem/progenitor cells.Chin Cancer res,1997,9:268-271.

　　［2］Yang JM,Goldenberg S,Gottesman MM， et al.Characteristics of p388/VMDRC.04,a simple,sensitive model for studying P-Glycoprotein antagonists. cancer Res,1994,54:730-737.

　　［3］郑国强，韩济生，刘叙仪，等.人胃腺癌阿霉素耐药细胞系BGC-823/DOX耐药机理的研究.中华外科杂志，1997，36：325-328.

　　［4］Stein U,Walther W,Shoemaker RH.Reversal of multidrug by transduction of cytosine genes into human colon carcinoma cells.J National Cancer institute,1996,88:1383-1391.