Autoradiographic study of dopamine transporter in rat models of Parkinson disease with　125I-β-CIT

LIU Zhenguo　CHEN Shengdi, SUN Wenshan，et al

　　Department of Neurology, Ruijin Hospital, Clinical and Research Center for Parkinson Disease, ShanghaiSecond Medical University, Shanghai 200025， China

　　【Abstract】　Objective　To study the value of imaging for dopamine transporter(DAT) with　125I-β-CIT. Methods　The rat models of hemiparkinsonism with either partial or complete lesions were rendered with 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Each rat was injected intravenously with　125I-β-CIT containing 40μCi. Coronal tissue sections were imaged by autoradiography. The levels of dopamine (DA) and its metabolites were measured by high performance liquid choromatography and electrochemical detection (HPLC-ECD). The tyrosine hydroxylase(TH)-positive cells and fibres in the substantia nigra and striatum of the rats were observed with immunohistochemical staining.Results　The radioactivities in the lesions of the striatum of both partial and complete hemiparkinsonian lesions of the rat models were 2.67±0.25 and 0.98±0.29，respectively ,and were singificantly decreased by 18% and 72%，respectively, as compared with those on the side without lesions. The levels of DA in the lesions of the striatum of partial and complete rat models were decreased by 39% and 98%, respectively. The loss of TH-positive cells and fibres in the substantia nigra and striatum was found in the lesions of the striatum of both partial and complete hemiparkinsonian rat models. Conclusion　The imaging study of DAT may be helpful for the early diagnosis of Parkinson′s disease and for the monitoring of the progression of this disease.

　　【Key words】　Carrier proteins; Parkinson disease；　　125I-β-CIT; Autoradiography

　　帕金森病（Parkinson disease,PD）病理基础是中脑黑质多巴胺(DA)能神经元及黑质纹状体通路变性死亡。中枢多巴胺转运蛋白(DAT) 位于DA能神经元突触前膜。中脑黑质DA能神经元变性将累及纹状体部位DA能神经终末DAT的密度。DAT密度的改变与DA能神经元数量的变化相一致［1］。黑质DA能神经元数量可以通过DAT功能显像进行半定量检测，为临床PD辅助诊断提供一种手段。

　　材料和方法

　　1．黑质部分和完全损毁PD大鼠模型制备［2］:SD大鼠60只，雄性，体重200～250 g。取20只大鼠，借助大鼠脑立体定向仪，将6-羟基多巴胺（6-OHDA）溶液12 μg/6 μl分2点注射至大鼠右侧黑质致密部，坐标定位：1点为前囟后5.0 mm，旁正中1.9 mm，硬膜下7.1 mm；另1点为前囟后5.0 mm，旁正中2.3 mm，硬膜下6.8 mm。2～3周后腹腔注射阿朴吗啡(APO) 0.1 mg/kg体重，取APO诱发旋转次数小于3转/min者作为黑质部分损毁模型。取另外40只大鼠，在上述黑质部位注射2点的基础上，于内侧前脑束(MFB)注射8 μg/4 μl 6-OHDA，坐标为：前囟后4.4 mm，旁正中1.7 mm，硬膜下7.7 mm。将APO诱发的旋转次数大于7转/min者作为黑质完全损毁模型。

　　2．125I-β-CIT［甲基-3β-（4-碘苯基）托烷-2β-羧酸盐］的标记［3］：采用氯胺-T法标记125I-β-CIT，标记率为75%～80%，放射化学纯度＞95%。

　　3．模型动物脑放射自显影：取正常大鼠、黑质部分损毁及完全损毁模型大鼠各6只，经尾静脉注射取125I-β-CIT 40 μCi，于注射后4 h断颈取脑，冰冻切片，与GS-250自显影仪扫屏显像曝光8 h，用图像分析系统对每只大鼠两侧相同的纹状体区分析4～6张脑片。对每张脑片图像的两侧纹状体及额叶皮层相对称的部位选取1个相同形状及面积大小的感兴趣区（ROI），对每个ROI进行光灰度测定，并计算各组同侧纹状体/皮层(ST/CX)灰度的比值，取其平均值，这一比值代表纹状体的相对放射计数，亦代表其DAT密度，可反映其纹状体DA能神经末梢以及黑质DA能神经元数目的变化。

　　4.高效液相-电化学法检测（HPLC-ECD）模型动物DA及其代谢产物含量：每组各取4只大鼠，麻醉后断头，在干冰上分离出双侧纹状体并称重，HPLC-ECD检测。

　　5.模型动物黑质及纹状体免疫组化染色：每组各取1只，经4%多聚甲醛灌注后，于纹状体和黑质部位冰冻切片，片厚50 μm，进行免疫组化ABC法酪氨酸羟化酶（TH）染色。

　　6.统计学处理：组内左右侧及组间比较采用Student t检验。

　　结果

　　1.动物脑组织放射自显影观察：正常大鼠纹状体区冠状位图像清楚可见纹状体部位有放射性浓集，左、右侧灰度相当。皮层、伏隔核以及黑质部位亦有轻度放射性浓集。黑质部分损毁及完全损毁模型损毁侧纹状体放射性浓集降低，黑质完全损毁模型降低更明显（图1）。黑质部分损毁模型右侧ST/CX比值较左侧降低了18%；黑质完全损毁模型降低了72%。从表1中可以看出模型动物左右侧纹状体之间ST/CX比值存在显著性差别，随着损毁程度加重，DAT密度降低明显，表明DAT密度降低程度与损毁程度成正比，β-CIT DAT功能显像可以反映早期黑质纹状体系统的病理变化及变化程度。

表1　125I-β-CIT在PD大鼠模型脑内ST/C比值及

　　各组间比较（±s）

　　注：同组左、右侧比较　* P＞0.05　　** P＜0.005； 与正常组同侧相比　△ P＜0.001

　　2.DA及其代谢产物含量：从表2可见，黑质部分损毁模型损毁侧（右侧）多巴胺（DA）、二羧苯乙酸（DOPAC）和3-甲氧-4-羧基苯乙酸（HVA）较左侧分别减少39%、41%和70%；黑质完全损毁模型右侧比左侧分别减少98%、96%和97%。表明部分损毁模型的DA生化能代表PD早期的生化改变。

表2　HPLC-ECD检测大鼠离体纹状体DA、DOPAC、

　　HVA的含量（±s μg/g湿组织）

　　注：同组左右侧相比　* P＜0.05，　** P＜0.001；与正常组同侧相比　△ P＜0.05，　△△ P＜0.001　　结合125I-β-CIT在PD大鼠放射自显影图像的灰度测定值，可以发现在部分损毁模型生化改变早期，DA含量降低39%时DAT自显影图像即可显示出左右侧差别。

　　3．TH免疫组化：在黑质部分损毁及完全损毁的PD模型上，6-OHDA未损毁侧（左侧）黑质致密带内可见密集的TH阳性细胞呈棕褐色，网状带内以及腹侧背盖（VTA）亦可见一些TH阳性细胞，左侧纹状体部位可见细而密集的TH阳性纤维。黑质部分损毁PD模型的损毁侧黑质致密带以及网状带尚存在一些TH阳性细胞，以网状带为多，纹状体亦见到相对密集的TH阳性纤维。在黑质完全损毁PD模型的损毁侧（右侧）黑质致密带以及网状带未见TH阳性细胞，VTA部位有少量TH阳性细胞，纹状体部位仅有少许细而稀疏的TH阳性纤维（图2）。

　　讨论

　　DAT是位于纹状体DA能神经元突触前膜的一种膜蛋白，DAT密度的改变与DA神经元数量的变化相一致。1993年有人用123I-β-CIT单光子发射计算机体层摄影术（SPECT）检测正常人和PD患者DAT功能显像，证实PD患者DAT下降［4］。

　　文献报道PD初期的壳核18F-Ddopa摄取率降低30%，表明18F-Ddopa正电子发射体层摄影术（PET）可以在PD亚临床期检测黑质DA能神经元的功能［5］。同时，也有资料表明早期PD患者基底节DAT功能较正常人降低31%～65%，因此，DAT PET或SPECT检测有助于PD早期诊断，甚至，可用于亚临床期PD的筛查。Marek等［6］应用123I-β-CIT SPECT检查8例早期偏侧PD患者和8名年龄、性别与PD患者相当的健康正常人，发现偏侧PD患者基底节DAT水平在有症状肢体对侧和同侧分别降低约53%和38%，且壳核DAT水平降低比尾核明显，表明123I-β-CIT SPECT有助于PD早期甚至亚临床期的诊断。利用DAT功能状态观察PD严重程度则是根据PD患者的临床功能评分来进行比较，但临床上无法结合纹状体部位生化和病理与DAT功能相匹配研究PD的早期病情及病情发展。

　　本实验建立的黑质部分和完全损毁偏侧PD模型，损毁侧纹状体DA含量分别降低39%和98%。免疫组化染色可见纹状体和黑质TH阳性纤维和神经元相应地稀疏及缺失，可模拟PD早期及晚期病理、生化改变。应用125I-β-CIT放射自显影研究了黑质部分及完全损毁的PD大鼠模型，并结合离体生化和TH免疫组化进行DA及其代谢产物检测和DA能神经元及其纤维形态学观察，发现当黑质部分损毁侧纹状体的DA含量较未损毁侧降低40%时，125I-β-CIT在纹状体部位的放射性浓集程度均见降低，与纹状体DA含量降低及TH免疫组化观察到TH阳性纤维稀疏程度相一致。表明125I-β-CIT显像不仅有助于PD早期诊断，而且可以用于病情监测，为123I-β-CIT SPECT 显像的临床应用提供了理论依据。

　　PD大鼠脑纹状体125I-β-CIT放射自显影， a：正常大鼠，两侧纹状体可见放射性浓集， b：部分损毁偏侧大鼠，损毁侧纹状体放射性浓集程度明显减弱， c：完全损毁偏侧大鼠，损毁侧纹状体放射性浓集程度更加降低

 图2 PD大鼠损毁侧纹状体显示部分和完全损毁大鼠纹状体稀疏的TH阳性纤维， a：正常对照， b：部分损毁， c：完全损毁

　　TH 免疫组化染色×80

　　基金项目：国家重点基础研究规划“脑功能和脑重大疾病基础研究”资助项目（G1999054000）；上海市卫生系统百名跨世纪优秀学科带头人培养计划资助项目（97BR001）；上海市科委青年科技“启明星”计划资助项目（97QMB1410、99QB14023）；上海市教委基金资助项目（99B08）

参考文献

　　1，Kaufman MJ,Madras BK.Severe depletion of cocaine recognition sites associated with the dopamine transporter in Parkinson′s-diseased striatum.Synapse,1991,49:43-49.

　　2，Carman LS,Gage FH,Shults CW.Partial lesion of the substantia nigra:relation between extent of lesion and rotational behavior. Brain Res ,1991,553:275-283.

　　3，沈鸣华，龚佳玲，李燕茹，等.125I-AIBZM的制备及与多巴胺受体的结合特性研究.中华核医学杂志，1996,16：162-165.

　　4，Innis RB,Seibyl JP,Scanley BE,et al.Single photon emission computed tomographic imaging demonstrates loss of striatal dopamine transporters in Parkinson′s disease.Proc Nat1 Acad Sci USA,1993,90:11965-11969.

　　5，Morrish PK,Sawle GV,Brooks DJ.Clinical and ［18F］dopa PET findings in early Parkinson′s disease.J Neurol Neuosurg Psychiatry,1995,59:597-600.

　　6，Marek KL,Seibyl JP,Zoghbi SS,et al.［123I］beta-CIT/SPECT imaging demonstrates bilateral loss of dopamine transporters in hemiparkinson′s disease. Neurology, 1996, 46:231-237.