王勇　解玉冰　马小军 2004-8-4 16:13:00 《生物工程进展》1999年第19卷第2期

　　摘要　壳聚糖作为一种阳离子聚电解质，由于其良好的生物相容性、原料易得及价格便宜而倍受从事生物微胶囊研究的科学工作者的关注。本文综述了壳聚糖和海藻酸钠制备生物微胶囊的原理、方法、影响因素和应用背景。

　　自从A．M．Sun发明海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）生物微胶囊（简称微胶囊）以来，微胶囊技术广泛用于人工器官研制，动植物细胞、微生物及酶固定化，药物控制释放［1］，使得微胶囊在生物医学工程以及其它生物技术领域具有了广泛的应用前景。

　　制备微胶囊的原理有多种，其中通过聚电解质络合原理制备微胶囊是采用较多的一种。通过这种原理制备微胶囊的显著优点是制备过程温和，微囊化的生物活性物质在制备过程中活性损失很少或不损失。通过这种原理制备微胶囊所选用的阴、阳离子聚电解质材料也有多种，本文着重介绍壳聚糖和海藻酸钠这两种天然聚电解质材料制备微胶囊的原理、方法、影响因素和应用背景。

　　1 壳聚糖和海藻酸钠反应原理

　　壳聚糖是通过甲壳素脱乙酰化制备的天然高分子直链多糖，化学名称为（1-4）-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖。海藻酸钠是存在于褐藻类中的天然高分子，从其结构上看是由β-1，4结构的D型甘露糖醛酸的钠盐（M）和α-1，4结构的L型古罗糖醛酸的钠盐（G）共聚而成。由于壳聚糖分子链上有大量的伯氨基，海藻酸钠的分子链上有大量的羧基，所以壳聚糖和海藻酸钠可以通过正、负电荷吸引形成聚电解质膜，反应简图如下：

　　2 制备方法

　　采用上述原理制备壳聚糖／海藻酸钠微胶囊，在制备方法上，可以分为一步法［2～17］、两步法［18］和复合法［19］。

　　2.1 一步法

　　采用一步法主要有两种方式。一种方式是将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊；最终得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖／海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层共三层，内部是液态的微胶囊［2—4］。另外一种方式是反向操作，即将海藻酸钠溶液滴入壳聚糖和氯化钙的混合溶液中形成微胶囊［4—17］。

　　2.2 两步法

　　这种合成方法类似于传统的APA微胶囊的制备方法。过程简述如下［18］：

　　(1)海藻酸钠溶液滴入氯化钙溶液形成海藻酸钙凝胶珠；

　　(2) 海藻酸钙凝胶珠再和壳聚糖反应形成微胶囊；

　　2.3 复合法

　　复合法是在上述两种方法基础上建立起来的，先制备壳聚糖／海藻酸钠微胶囊，然后再以双功能团分子对微胶囊的表面进行修饰，制备过程如下［19］：

　　(1) 海藻酸钠溶液乳化、凝胶化；

　　(2)凝胶化海藻酸盐与壳聚糖进行反应形成微胶囊；

　　(3)微胶囊用戊二醛、1，6-己二异氰酸脂或苯四甲酸二酐溶液进行表面交联。

　　上述三种制备方法各有优缺点。一步法的显著优点是制备方法简单，成囊速度快，微囊化物质不容易在制备过程中流失，比较适合于蛋白分子的微囊化。但是，由这种方法制备的微胶囊球性度和光洁度较差，制备过程中微胶囊之间容易粘接。两步法制备的微胶囊球性度和光洁度好，但是制备过程相对繁琐；而且，在制备海藻酸钙胶珠时，微囊化物质容易流失，因此，这种方法相对而言更适合于细胞的微囊化。复合法制备的微胶囊强度较好，但也存在着制备过程繁琐这样的缺点，而且制备条件激烈。因此，这种方法较适合于对环境不很敏感的某些微生物进行微囊化。

　　3 影响微胶囊性能的主要因素

　　在壳聚糖／海藻酸钠微胶囊的研究中，主要考察的因素有：壳聚糖分子量、pH值和溶液浓度等。这些因素对微胶囊性能的影响程度主要是通过对微胶囊的强度和控释性来表征的。

　　3.1 壳聚糖分子量对微胶囊强度与控释性的影响

　　从Polk等［5］和Goosen等［18］的实验可以得出这样一个结论：壳聚糖分子量对微胶囊的强度和控释性的影响是最主要的。

　　polk等在实验中发现：高分子量壳聚糖制备的微胶囊强度较低；低分子量壳聚糖制备的微胶囊强度较高；而二者按照一定比例混合制备的微胶囊的强度最高。Goosen等发现：随着壳聚糖分子量的降低，制备的微胶囊强度提高。但是，当壳聚糖的分子量过低时，所制备的微胶囊的韧性或者弹性开始降低。

　　polk等发现：牛血清白蛋白在高分子量壳聚糖制备的微胶囊中释放速度要比在低分子量壳聚糖制备的微胶囊中慢，而在混合壳聚糖制备的微胶囊中释放的速度最慢。Huguet等［6－7］也发现，高分子量壳聚糖制备的微胶囊释放血红蛋白的速度要慢于低分子量壳聚糖制备的微胶囊。

　　根据微胶囊强度和控释性分析，壳聚糖分子量对制备微胶囊性能的影响主要由两方面调控：①壳聚糖进入海藻酸钠体系发生络合反应的深度；②单个壳聚糖分子结合海藻酸钠负电荷位点数，或者说在海藻酸钠分子间架桥的能力。对于同样分子量的壳聚糖来讲，如果进入海藻酸钠体系越深，所形成微胶囊的强度就会越高，控释性也相应就越强；而对于不同分子量的壳聚糖来讲，如果进入海藻酸钠体系的深度一样，分子量越大的壳聚糖和海藻酸钠结合的位点数就越多或者说在海藻酸钠间架桥的能力就越强，所形成的微胶囊的强度也会越高，控释性相应就会越强。介于这两点，无论大分子量的壳聚糖还是小分子量的壳聚糖对微胶囊强度和控释性分别都有正反两方面的影响。因此，很好地控制分子量的大小是决定微胶囊性能的关键因素。

　　3.2　pH值

　　对微胶囊强度和控释性的影响pH值也是影响微胶囊性能的一个主要因素。在微胶囊的制备、后处理和存放过程中，壳聚糖溶液、后处理溶液和存放溶液的pH值对微胶囊的性能都有一定影响。

　　polk等［5］发现：pH值为5.5时，制备的微胶囊强度最高；高于或低于5.5，制备的微胶囊强度略有下降。Knorr等［2］为了提高微胶囊的强度，在制备微胶囊后，用不同种类和不同pH值的缓冲溶液对微胶囊进行后处理。结果表明：使用不同溶液进行后处理，微胶囊的机械强度不同。磷酸盐缓冲溶液处理的微胶囊机械强度最差；pH3的硼砂缓冲溶液处理的微胶囊机械强度相对较好，能承受住6.28×103Pa的压力；而pH8～9TrizmaBase溶液处理的微胶囊的41机械强度最好，能承受住2.18×104Pa的压力。

　　huguet等［6－7］和Kim等［8］发现：随着pH值的升高，微胶囊释放蛋白的速度增加；而且释放速度随蛋白分子量的降低而增加。最近，Lee等［9］分别用不同pH值的壳聚糖溶液对愈创木酚甘油醚进行微囊化，结果表明：在pH等于4.8时，微胶囊的控释性最强，释放愈创木酚甘油醚的速度最慢；在pH值低于或高于4.8时，微胶囊的控释性都较弱，释放愈创木酚甘油醚速度都较快。另外，Polk等［5］在实验中发现：同样条件下制备的微胶囊在不同pH值的存放溶液中所表现的控释性也不同，微囊化的牛血清白蛋白释放速度随着存放溶液pH的降低而减慢。

　　pH值对微胶囊的各方面的性能产生影响，是因为影响了壳聚糖所带电荷、空间构象以及和海藻酸盐的相互作用。另外，pH值对包埋物质的空间构象以及所带电荷也会有一定的影响，从而对微胶囊的控释性也产生影响。

　　3.3 壳聚糖浓度对控释性的影响

　　polk等［5］考察0.1％（w／v）到0.2％（w／v）的壳聚糖溶液制备微胶囊时，发现牛血清白蛋白的释放速率随壳聚糖浓度的升高而升高。但是Kim等［8］发现：随着壳聚糖的浓度的继续升高，如从0.25％（w／v）升高到1％（w／v），微囊化牛血清白蛋白的释放速率开始逐渐减慢，微胶囊的控释性增强。Huguet等［6］的试验也证实了这一点，当用0.2％（w／v）的壳聚糖溶液制备微胶囊时，制备过程中微囊化的血红蛋白释放90％以上；而用0.8％（w／v）的壳聚糖溶液制备微胶囊时，制备过程中微囊化的血红蛋白释放仅1％。

　　上述试验说明，壳聚糖浓度对微胶囊控释性的影响应该分成两个区间来考虑，即：在一定低浓度范围（＜0.25％）内随着壳聚糖浓度的升高，微胶囊的控释性渐弱；而超出这个范围（＞0.25％），随着壳聚糖浓度的升高，微胶囊的控释性逐渐增强。

　　3.4 其它因素的影响

　　除了上述三种因素之外，其它考察的因素有：添加剂、海藻酸钠浓度、壳聚糖侧链结构、成囊反应时间等。

　　knorr等［2］和Daly等［3］发现葡萄糖作为一种可塑剂加入到壳聚糖溶液中有利于微胶囊强度的提高。Okhamafe等［10］发现乙酸丁二酸羟丙基甲基纤维（HPMCAS）可以作为一种微胶囊的控释调节剂。Polk等［5］在实验中发现海藻酸钠浓度是影响微胶囊控释性的一个因素，尤其在使用低分子量壳聚糖制备微胶囊时，海藻酸钠浓度的影响就更为显著。

　　Dunn等［11］和Goosen等［18］对壳聚糖进行了化学改性，目的是通过延长壳聚糖伯氨基的手臂来提高壳聚糖与海藻酸钠的反应活性。然而，壳聚糖的改性并没有明显改善微胶囊的强度，说明空间位阻效应不是影响微胶囊成囊反应的主要因素。Rha等［4］和Polk等［5］发现成囊反应时间对微胶囊性能影响不是很大，可能的原因是壳聚糖和海藻酸钠络合反应速度非常快。

　　4 应用背景

　　从壳聚糖／海藻酸钠微胶囊目前的研究结果来分析，其可能的应用背景是：作为药物控释载体、细胞培养微反应器、基因运载工具和人工器官以及分离介质等。

　　4.1 药物控释载体

　　蛋白、多肽等生化物质的微囊化是一个正在发展而又非常有前景的控释方法。同时，微胶囊还可以增加药物稳定性，降低药物在体内的副作用，延长药物疗效。可以通过控制壳聚糖的分子量、pH值、浓度、离子强度等因素来制备具有不同控释效果的微胶囊。例如，微囊化的血红蛋白在4℃水中，30天内仅释放10％［7］；微囊化的胰岛素在pH7.4条件下，24小时释放78.8％［12］；微囊化的硝化呋喃托英在pH7.4的缓冲溶液中，6小时释放70—80％［13］。这些结果预示：通过优化各种制备微胶囊的参数，微囊化的血红蛋白可以作为红血球的理想替代物；微囊化的胰岛素可以作为一种治疗糖尿病的缓释口服药物；微囊化硝化呋喃托英可以作51为一种治疗泌尿系统感染的缓释口服药物。

　　4.2 细胞培养微反应器

　　kim等［14］用壳聚糖／海藻酸钠微胶囊包埋杂交瘤细胞取得了很好的实验结果。微囊化培养的细胞密度可以高于悬浮培养细胞密度两个数量级；微胶囊内生产的单抗浓度是悬浮培养的20倍，因而利于分离产物和提高产物的纯度。但是，由于氧扩散阻力的存在，固定化细胞密度随微胶囊的尺寸增加而相应的降低［15］。

　　4.3 基因运载工具和人工器官

　　alexakis等［19］将包埋有小牛胸腺DNA的壳聚糖／海藻酸钠微胶囊通过管饲法注入小鼠体内，经检测小鼠粪便发现微胶囊通过小鼠消化系统能够回收。这表明：壳聚糖／海藻酸钠微胶囊具有一定的强度，可以作为DNA的保护屏障。孙多先、李涛等［20］通过海藻酸钠／壳聚糖／海藻酸钠微胶囊对肝细胞进行包埋，微囊化肝细胞在RPMI-1640培养液中17天内保持活性，能合成并释放低分子量的蛋白质。

　　4.4 分离介质

　　传统亲和色谱分离技术中存在着传质阻力大、选择性和配体利用效率低等缺点。微胶囊技术为如何解决这些问题提供了一个新思想。Daugulis等［16］将蓝葡聚糖用壳聚糖／海藻酸钠微胶囊进行固定化，并进行了从牛血清中分离牛血清白蛋白的尝试。Li等［17］也利用类似的方法将牛血清白蛋白从其盐溶液中进行分离。实验结果表明：壳聚糖／海藻酸盐微胶囊具有很强的吸收能力，有效地增加了配体的利用效率。

　　5 面临的问题和可能的解决办法

　　壳聚糖／海藻酸钠微胶囊的研究已经取得了一定进展。但是，这种微胶囊面临着这样一个比较突出的问题：如何在保持生物活性物质活性的同时改善微胶囊的通透性和提高其强度，或者说提高微胶囊在某些环境中的稳定性。这种问题的解决有待于对壳聚糖、海藻酸钠这类天然高分子多糖以及由它们制备的凝胶和溶液各方面性质的认识进一步加强；有待于对微囊化方法的改进；有待于对各种制备参数的优化。相信通过对这些问题进一步加深认识，能够制备出适宜多种需要，具有良好性能的壳聚糖／海藻酸钠生物微胶囊。本实验室在这方面做了大量工作，目前已经制备出性能较好的微胶囊，可望通过进一步努力，今后将壳聚糖／海藻酸钠微胶囊用于工业化。

　　国家自然科学基金（29576264）与辽宁省自然科学基金（962070）资助项目

　　参考文献（略）